生物化学实验报告
姓 名：XXXXX
学 号：XXXXXXXXXXXXXX
专业年级：XXXXXXXXXXXXXXX
组 别：第X实验室
生物化学与分子生物学实验教学中心
一、实验目的
1、掌握薄层层析法的实验原理。
2、掌握氨基酸薄层层析法的基本操作方法。
3、掌握如何根据移动速率（Rf值）来鉴定被分离的物质（即氨基酸混合液）的方法。
二、实验原理
1、薄层层析法是色谱分析技术的一种。
是将吸附剂、载体或其他活性物质均匀涂铺在平面板（如玻璃板、塑料片、金属片等）上，形成薄层（常用厚度为0.25毫米左右）后，在此薄层上进行层析分离的分析方法。
一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。（即通过吸附-解吸-再吸附-再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）
硅胶吸附薄层层析：
吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶。硅胶：表达式为SiO2·XH2O。层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基（－Si－OH），这种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附.
硅胶吸附薄层层析的特点：
② 硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。
② 硅醇基显较弱的酸性，因此，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。
③ 硅胶的活化温度通常为105℃－110℃，不能过高。
2、氨基酸与茚三酮的显色反应：
茚三酮水化后生成水化茚三酮，它与氨基酸的羧基反应生成还原茚三酮、氨及醛，与此同时，还原茚三酮又与氨及茚三酮缩合生成紫红化合物而使氨基酸斑点显色。
3、混合氨基酸被分离后在薄层层析图谱上的位置用相对迁移率—Rf值（rate of flow）来表示。
层析中，物质沿溶剂运动方向迁移的距离与溶液前沿的距离之比为Rf值。
即：
=
由于物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf值）也是恒定的，因此可以根据Rf值来鉴定被分离的物质。
三、材料与方法：
（一）、材料：分析样品（氨基酸混合液）、吸附剂（硅胶）、粘合剂（0.5%的羧甲基纤维素钠）、氨基酸的异丙醇溶液（丙氨酸、精氨酸、甘氨酸）、展开-显色剂（正丁醇、乙酸、水、茚三酮溶液）；
（二）、器材：层析板（5cm×15cm）、尺子、铅笔、小烧杯、玻棒、量筒（10ml）、吹风机、毛细玻璃管、层析缸、药匙、烘箱；
（三）、方法：
1、实验流程：
2、操作步骤：
（1）薄层板的制备：
（2）点样：
（
3）层析：
（
4）显色：
四、结果与讨论：
（一）结果：
1、实验数据：
根据Rf=计算，得：
2、现象：
（1）点样时，点扩散后大小适中，不超2mm。
（2）层析时，浸入展层-显色液时层析板放得比较正，在层析约40min后溶剂前缘到超过达层析板的1/2处，取出并烘干。溶剂前沿是一条较平整的水平线。
（3）在利用烤箱烘干后，层析板上出现6个的紫红色斑点，混合点2显色较浅。
（4）第一次制备薄层板时，涂板非常不均匀；第二次制备的薄层板薄厚较为均匀。
（二）结果讨论：
1、结果上的误差问题：
在实验的结果中，我们可以发现混合点2的Rf=0.427≠0.417（测定的标准值），混合点3的Rf=0.523≠0.510（测定的标准值）。原因可能有：
（1）在整个实验过程中，层析板的制作是基础，硅胶分布的均匀与否直接影响了实际的实验。而从溶剂前沿并不完全水平可以知道，实验所用的层析板质量不是很好，一定程度上影响了实验的数据测定，导致实验的误差。
（2）人为误差的存在，在判定斑点前沿和测量距离时，存在一定的误差，导致了结果上的不一致性，但这类影响较小。
2、结果反思：
学习制作层析板的技巧，多做多练，在练好基础技能的前提下，可以提高实验的准确率和成功率。
3、结论：
薄层层析法操作较为简单，在实验的结果上也比较的精确，能有效地分离出样品各组分。运用在本实验，效果也较好。
根据计算所得的数据，可见混合点1的Rf（0.262）值等于精氨酸的Rf值（0.262），混合点2的Rf值（0.427）接近于甘氨酸的Rf值（0.417），混合点3的Rf值（0.523）接近于丙氨酸的Rf值（0.510）。
又由实验原理可得，由于吸附剂对不同氨基酸的吸附力不一样，不同氨基酸在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合氨基酸样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。所以每一种氨基酸所对应的Rf值应是唯一的。
所以我们可以得出如下结论：
在一定误差允许的范围内，混合点1所对应的氨基酸为精氨酸，混合点2所对应的氨基酸为甘氨酸，混合点3所对应的氨基酸为丙氨酸。
最终可以得到结果：混合的氨基酸溶液中，存在有丙氨酸、甘氨酸和精氨酸三种氨基酸。
第二篇：凝胶层析试验报告
摘要
凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。 GFC一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。本实验用凝胶色谱法对食用油中的甘油三酯进行了分离提取。
关键词：凝胶色谱 甘油三酯 食用油
第一章 简介
凝胶层析法凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。
一 、凝胶的选择
根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用Sephadex G-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用Sephadex G-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4。如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。
二、 柱的直径与长度
根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。
三、凝胶柱的制备
凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。
凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速，千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。
四、加样和洗脱
凝胶床经过平衡后，在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。一般样品体积不大于凝胶总床体积的5％-10％。样品浓度与分配系数无关，故样品浓度可以提高，但分子量较大的物质，溶液的粘度将随浓度增加而增大，使分子运动受限，故样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5-2。样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液中洗管壁，使其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速，然后分部收集洗脱液，并对每一馏份做定性、定量测定。
五、凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存
一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02％的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。 如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70％、90％、95％乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90％以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。
六、 凝胶层析的应用
1. 脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。
2.用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。
3.测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。
4. 高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液。
第二章 实验内容
一、实验目的
通过从粗油中分离甘油三酯，学习运用凝胶色谱法分离油脂中各个成分的方
法。
二、实验原理
吸附色谱是利用吸附剂对被分离物质的吸附能力不同，用溶剂或气体洗脱，以使组分分离。常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等有吸附活性的物质。硅胶色谱频繁使用在脂质中的单一脂质，糖脂质以及磷脂质的分离。各种脂质被硅胶吸附，随着洗脱溶液的极性增加，各种极性不同的化合物被分离出来。
三、实验材料与试剂
正己烷200mL、、乙醚15mL、蒸馏水1.3mL、硅胶（100目左右）25g
四、实验仪器
层析柱(1.5×75cm) 、250mL 三角容量瓶、分析天平（0.001g）、真空浓缩装
置、搜集瓶
五、实验提取工艺流程
1. 活化硅胶（110度，6小时干燥）25g中加入5%蒸馏水使其部分钝化并充分混匀放置30分钟。加入正己烷至刚好淹没硅胶为止并用超声波脱气3分钟。
2. 层析柱底部放入脱脂棉少许（防止硅胶泄漏），将硅胶放入到层析柱中正己烷溶液要没过硅胶层表面。
3. 准确称取食用油1±0.001 g 加入到硅胶层析柱中用150mL 正己烷/乙醚（87∶13，v/v）洗脱，洗脱速度为2-3滴/min。洗脱时表面不能干和。
4. 收集的洗脱液用真空浓缩装置浓缩至无有机溶剂气味为止。
5. 准确称取浓缩物质量
参考文献
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[3]杨放.谭少云.朱少璇 凝胶色谱法测定头孢丙烯及其制剂中的高分子杂质 -中国抗生素杂志2011(9)