叶绿体中色素的提取和分离

一、实验目标

1、知识方面

（1）探究叶绿体中含有几种种色素：理解它们的特点及与光合作用的关系

（2）了解纸层析法的原理。

2、能力方面

掌握提取和分离叶绿体中色素的方法。

3、情感态度与价值观方面

认识生物科学的价值，乐于学习生物科学，养成质疑、求实、创新及勇于实践的科学精神和科学态度

二、实验原理

1、色素提取的原理：叶绿体中的色素能溶于有机溶剂中，故可用丙酮和无水乙醇提取色素。

2、色素分离的原理：叶绿体中的各种色素在层析液中的溶解度不同。溶解度大的色素，在滤纸上随层析液的扩散速度快；溶解度小的色素，在滤纸上随层析液的扩散速度慢。

三、实验准备

实验材料：新鲜的绿叶（如新鲜菠菜叶片）。

实验仪器及用具：定性滤纸，研钵，玻璃滤斗，脱脂棉，尼龙布，毛细吸管，剪刀，药勺，量筒（10mL），天平，试管，试管架，滴管，培养皿，三角瓶，烧杯

试验试剂：无水乙醇（或丙酮），层析液（CCl4），石英砂（SiO2）和碳酸钙（CaCO3）

四、实验步骤

1、叶绿体色素的提取

（1）取菠菜新鲜叶片5g，洗净，擦干，去掉中脉，剪碎，放入研钵中。

（2）向研钵中加入少许碳酸钙和二氧化硅，再加10mL无水乙醇，进行迅速、充分研磨（二氧化硅有助于研磨得充分，碳酸钙可防止研磨中色素被破坏）。

（3）将研磨液迅速倒入漏斗（漏斗基部放一块单层尼龙布）中进行过滤。将滤液收集到试管中，及时用棉塞将试管口塞严。

2、制备滤纸条

用预先干燥处理过的定性滤纸，将滤纸剪成长10 cm、宽 1cm的滤纸条，在滤纸条的一端剪去两角（防止层析液在滤纸条的边缘扩散过快），并在距离这一端 1cm处用铅笔画一条细的横线。

3、画滤液细线

用毛细吸管吸取少量滤液，沿铅笔线均匀地画出一条细而直的滤液细线。待滤液干后，再画二三次。

4、分离叶绿体中的色素

将3 mL层析液到入烧杯中，将滤纸条（有滤液细线的一端朝下）略微斜靠着烧杯的内壁，轻轻地插入到层析液中，随后用培养皿盖盖上烧坏。注意，不能让滤液细线触及层析液。

5、观察与记录

观察滤纸条上出现了几条色素带，以及每条色素带的颜色。将观察结果记录下来。

五、结果分析

1、色素在滤纸条上的分布如下图：

2、叶绿体中的色素是有机化合物，不溶于水，能够溶解在有机溶剂中，所以用丙酮、乙醇可以将存在于叶绿体类囊体膜上的色素溶解，从而提取色素。经过提取、过滤得到的色素滤液为绿色，叶绿体色素见光易分解，应将色素滤液避光保存。

3、层析液是一种脂溶性很强的有机溶剂，叶绿体中的色素在层析液中的溶解度不同，溶解度高的随层析液在滤纸上扩散得快，溶解度低的在滤纸上扩散得慢，所以用层析法来分离这四种色素。

六、注意事项

1、各种试剂用途总结：

丙酮的用途是提取（溶解）叶绿体中的色素，

层析液的的用途是分离叶绿体中的色素；

石英砂的作用是为了研磨充分，

碳酸钙的作用是防止研磨时叶绿体中的色素受到破坏；

2、提取色素

（1）注意选材：应选择新鲜、浓绿、柔软的叶片（色素含量多）。

（2）研磨要充分、迅速，用纸盖住研钵口，试管口要加塞。叶绿素不稳定，已被细胞中的叶绿素酶水解，迅速研磨可以尽量使叶绿素不被水解；充分研磨可以使叶绿体完全破裂，便于提取较多的色素。

（3）丙酮等有机溶剂的用量不宜过多，过多会影响色素的浓度，过少则不易过滤。

（4）用尼龙布过滤，不能使用滤纸。（滤纸会吸附色素）

3、滤纸条

（1）干燥，有利于色素扩散。

（2）双手尽量不接触纸面，以免手上的油脂或其他脏物污染滤纸。

（3）剪角：边缘扩散快，剪角可使边加长，保证色素水平扩散。

（4）滤纸条的高度要尽量高出烧杯，高出部分直角弯折，最好将其固定在培养皿盖上。

4、画滤液细线（细、直、齐；干燥后再重复画线，否则细线过粗，色素不易分开；重复：增加色素量，使实验效果明显）

5、分离色素

（1）层析液不能没及滤液细线，否则色素将溶解在层析液中。

（2）滤纸条尖端向下，斜靠壁。（贴壁会影响层析）

（3）加盖。（层析液易挥发，且有毒）

6、色素的位置和功能

叶绿体中的色素存在于叶绿体类囊体薄膜上。

叶绿素a和叶绿素b主要吸收红光和蓝紫光；

胡萝卜素和叶黄素主要吸收蓝紫光及保护叶绿素免受强光伤害的作用。

Mg是构成叶绿素分子必需的元素。

七、结论

八、思考讨论

1、为什么要选取新鲜的颜色较深的叶片做实验材料？

2、提取和分离叶绿体中色素的关键有哪些？

3、“没有光不能合成叶绿素”与“避光保存叶绿体色素滤液”是否矛盾？为什么？

第二篇：叶绿体色素的提取分离实验报告

叶绿体色素的提取分离、理化性质实验报告

第一部分 提取与分离

一 实验目的

学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法

二 实验原理

叶绿体是进行光合作用的细胞器。叶绿体中的叶绿体a(C55H72O5N4Mg)、叶绿素b(C55H72O6N4Mg)、胡萝卜素(C40H56)和叶黄素(C40H56O2)与类囊体膜结合成为色素蛋白复合体。这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。提取液可用薄层色谱法加以分离与鉴别。

薄层色谱分析法是将吸附剂均匀的涂在玻璃板上成一薄层，将此吸附剂薄层做固定相，把待分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂做流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂中。流动相通过毛细管作用由下而上的逐渐浸润薄层板，并带动样品在板上也向上移动，样品中各组分在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、脱附、再吸附、再脱附……的过程。由于吸附剂的吸附能力大小不同，吸附力强的物质相对移动慢一些，而吸附力弱的则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度而彼此分开。

三 实验材料与试剂

1 新鲜的菠菜叶片

2 体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂(石油醚:丙酮:苯=7:5:1，体积比)

3 天平，研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸

四 实验步骤

(一) 色素提取液的制备

1 取新鲜叶片4至5片(2g左右)，洗净，擦干叶表面，去中脉剪碎，放入研钵中。

2 研钵中加入少量碳酸钙粉末，加2至3ml体积分数为95%的乙醇，研磨至糊状，再加10至15ml体积分数为95%的乙醇，上清液用漏斗过滤，残渣再用10ml体积分数为95%的乙醇冲洗一次，一同过滤于三角瓶中，即制成叶绿体色素提取液。提取液应避光保存。

(二) 叶绿体色素的分离

1 取硅胶预制板一个，用点样毛细管吸取上述提取液，平行于硅胶板的短边，距下边缘约1cm处用毛细管划线，风干后再划第二次，重复操作3至4次。

2 在干洁的层析缸中加入适量的展开剂，高度约0.5cm，将硅胶预制板带有色素的一端放下，使其浸入展开剂中(但不要使待测样品浸入展开剂中)。迅速盖好层析缸盖。此时，展开剂借毛细管作用沿硅胶预制板向上扩散，并把叶绿体色素向上推动，不久即可以看到各种色素的色带。

3 当各种色素的得到较好分离，展开剂前沿接近硅胶预制板上端近边缘处时，取出硅胶预制板，并迅速用铅笔标出展开剂前沿和各色素带的位置。

五 实验结果及数据、分析

经过薄层色谱分离后，叶绿素a为蓝绿色，叶绿素b为黄绿色，叶黄素为鲜黄色，胡萝卜素为橙黄色。各色素带在薄层中的位置可用相对比移值Rf表示，即

Rf=斑点中心到原点的距离/溶剂前沿至远点的距离

由于不同组分具有不同的Rf值，所以比较Rf值可以进行定性分析。但是，实验中的很多因素也可以影响到Rf的值，例如吸附剂的种类、层析缸的形状大小、温度、展开剂的浓度等等。

最后测得数据：Rf(胡萝卜素)=0.972，Rf(叶绿素a)=0.908, Rf(叶绿素b)=0.856，Rf(叶黄素)=0.804。

第二部分 理化性质

一 实验目的

验证叶绿体色素的理化性质

二 实验原理

叶绿素是一种由叶绿酸和叶绿醇形成的复合酯，故可与碱起皂化反应而生成甲醇和叶绿醇及叶绿酸盐，产生的盐能溶于水，故可用此法将叶绿素和类胡萝卜素分开。叶绿素吸收光量子而转变成为激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回倒基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容易受到强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被H+所取代而生成褐色的去镁叶绿素。去镁叶绿素遇铜则成为铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。

三 实验材料及试剂

1 新鲜菠菜叶片

2 刻度试管，小试管，试管架，水浴锅，10ml移液管

3 体积分数为95%的乙醇，苯，醋酸铜粉末，质量分数为5%的稀盐酸，醋酸-醋酸铜溶液，氢氧化钾-甲醇溶液

四 实验步骤

(一) 光对叶绿素的破坏作用

1 取2支小试管，各加入2.5ml叶绿体色素乙醇提取液，并用体积分数为95%的乙醇稀释一倍。其中一支放在直射日光下，另外一支放在暗处或用锡箔纸包严，40分钟后对比观察颜色有何变化。

2 另取本实验中用薄层层析分离成的硅胶色谱板一个，按长度方向将一半用黑色纸或塑料薄膜包住，放在直射日光下，半小时后观察，比较色谱板上各色素的颜色有何变化。

(二) 皂化作用

1 取1支10ml刻度的试管加入3ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，加入1ml氢氧化钾-甲醇溶液，充分摇匀。

2 片刻后，加入3ml苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1ml左右的蒸馏水，轻轻摇匀(勿激烈摇荡)，然后置于试管架上静置分层。若溶液不分层，则用滴管吸取蒸馏水，沿管壁滴加，边滴加边摇动，直到溶液开始分层时，静置。

(三) H+和Cu+对叶绿素分子中的Mg+的取代作用

1 取两支试管，第一支试管中加叶绿体色素提取液5ml，作为对照。第二支试管中加入叶绿体色素提取液5ml后，再加入质量分数为5%的HCl数滴，摇匀，观察溶液颜色变化。当溶液变褐后，再加入少量醋酸铜粉末，60℃水浴加热，观察溶液颜色变化情况，并与对照试管相比较。

2 取新鲜植物叶片两片，放入试管中，加醋酸-醋酸铜溶液，使之没过叶片，90℃水浴加热，随时观察叶片颜色的变化，直至颜色不再变化为止。

(四) 荧光现象的观察

取一支小试管加入3ml浓的叶绿素乙醇提取液，在直射光下照射，比较溶液的透射光与反射光的颜色有何不同。

五 实验结果及分析

1 在光对叶绿素的破坏的实验中，未观察到提取液的颜色变化以及个色素的颜色变化，分析其原因，可能是因为当时的阳光已经不够强烈，不足以对色素达到破坏的程度，而且放置的位置不够好，不能使样品被阳光直射，而且放置的时间也可能不够长，所以导致此试验失败。

2 静置一段时间之后，溶液逐渐分为两层，下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素a和叶绿素b(以及少量的叶黄素)，呈绿色；上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素，呈黄色；最下层有少量黄色乳状液体，这是由于皂化液沉积引起的。

3 ·当加入了少量的盐酸后，溶液在短时间内变为了褐色，再加入少量的醋酸铜粉末，水浴加热一段时间后，溶液又重新变为了蓝绿色。

·90℃水浴加热约半个小时以后，叶片变为黄色，约一个半小时以后，叶片又逐渐恢复为蓝绿色。

4 荧光现象:透射光下呈绿色，反射光下呈红褐色。

第三部分 实验感想

1 实验过程中，同组人员的配合十分重要，因为本实验的步骤很多，所以两个人配合起来的话可以大大的提高实验效率。

2 在用毛细管划线时，不可以画的太粗，否则会影响分离的时间，而且效果也不太好。

3 做叶绿素光解的实验时，要多等一些时间，否则时间太短的话实验现象不明显，或者没有出现应有的实验现象。