实验五 血液中谷丙转氨酶活力的测定
【目的和要求】
了解转氨酶在代谢过程中的重要作用及其在临床诊断中的意义，学习转氨酶活力测定的原理和方法。
【原理】
生物体内广泛存在的氨基移换酶也称转氨酶，能催化α-氨基酸的α-氨基与α-酮基酸的α-酮基互换，在氨基酸的合成和分解、尿素和嘌呤的合成等中间代谢过程中有重要作用。转氨酶的最适pH接近7.4，它的种类甚多，其中以谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（简称谷草转氨酶）和谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简称谷丙转氨酶）的活力最强。它们催化的反应如下。
正常人血清中只含有少量转氨酶。当发生肝炎，心肌梗死等病患时，血清中转氨酶活力常显著增加，所以在临床诊断上转氨酶活力的测定有重要意义。
测定转氨酶活力的方法很多，本实验采用分光光度法。谷丙转氨酶作用于丙氨酸α-酮戊二酸后，生成的丙酮酸与2，4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙。
丙酮酸2，4-二硝基苯腙加碱处理后呈棕色，可用分光光度法测定。从丙酮酸2，4-二硝基苯腙的生成量，可计算酶的活力。
【操作方法】
1．标准曲线的给制：取6支试管，分别标上0，1，2，3，4，5六个号。按下表所列的次序添加各试剂。
2,4-硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙。底物中的α-酮戊二酸与2，4-二硝基苯肼反应，生成α-酮戊二酸苯腙。因此，在制作标准曲线时，须加入一定量的底物，（内含α-酮戊二酸）以抵消由α-酮戊二酸产生的消光影响。
先将试管置于37℃恒温水浴中保温10min以平衡内外温度。向各管内加入0.5ml2，4-二硝基苯肼溶液后再保温20min，最后，分别向各管内加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml。在室温下静置30min，以0号管作空白，测定520nm的光吸收值。用丙酮酸的微摩尔数为横坐标，光吸收值为纵坐标，画出标准曲线。
2．酶活力的测定：取2支试管并标号，用第1号试管做为未知管，第2号试管做为空白对照管。各加入谷丙转氨酶底物0.5ml,置于37℃水浴内10min，使管内外温度平衡。取血清0.1ml加到第1号试管内，继续保温60min。到60min时，向两支试管内各加入2，4-二硝基苯肼试剂0.5ml，于37℃保温20min,然后再向2支管中加入0.4mol/L氢氧化钠溶液5ml。在室温下静置30min后，测定未知管的520nm波长光吸收值（显色后30min至2小时内其色度稳定）。在标准曲线上查出丙酮酸的微摩尔数。（用1μmol丙酮酸代表1.0单位酶活力）。计算每100ml血清中转氨酶的活力单位数。
【试剂和器材】
一`试剂
1．试管及试管架
2．吸管
3．恒温水浴
4．分光光度计
二`器材
1．0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）
2．2.0μmol/ml丙酮酸钠标准溶液。
取分析纯丙酮酸钠11mg溶解于50ml磷酸缓冲液内 [当日配制]。
3．谷丙转氨酶底物。
取分析纯α-酮戊二酸29.2mg DL-丙氨酸1.78g克置于小烧杯内，加1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸调整pH至7.4后，加磷酸缓冲液至100ml。然后加氯仿数滴防腐。此溶液每毫升含α-酮戊二酸2.0μmol，丙氨酸200μmol。[在冰箱内可保存一周]。
4．2，4-二硝基苯肼溶液。
在200ml锥形瓶内放入分析纯2，4-硝基苯肼19.8mg，加100ml 1 mol/L盐酸。把锥形瓶放在暗处并不时摇动，待2，4-二硝基苯肼全部溶解后，滤入棕色玻璃瓶内置 [冰箱内保存]。
5．0.4mol/L氢氧化钠溶液。
6．人血清 [冰箱内保存]
第二篇：谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定
谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定
一、实验目的 1.用纸层折法观察肝脏丙转氨酶ALT的转氨作用 2.用分光光度法测定血清丙转氨酶的活力 3.学习治疗检测SGPT的方法及原理 4.了解检测肝损伤模型的制备及SGPT在科研中的应用。 二、仪器与试剂 1实验材料 动物肝脏 2实验试剂 10.9NaCl溶液 2海砂 31谷氨酸溶液1KOH溶液中和 41丙酮酸钠溶液用1KOH溶液中和
50.1KHCO3溶液 60.025一溴乙酸溶液用1KOH中和 72乙酸溶液 8酚的饱和水溶液将2份酚和2份水按重量计算混合放入分液漏斗中振荡。静止24h以后分层将下部酚层放入瓶中备用。新配制的酚展层剂可以反复使用1周。 90.1水合茚三酮的正丁醇溶液 100.1标准谷氨酸溶液 110.1标准丙氨酸溶液 121KOH溶液 谷丙转氨酶活性的鉴定纸层析法 一、实验原理 观察肌肉糜中谷丙转氨酶所催化的氨基移换反
应。通过纸层析法检查底物谷氨酸的减少和产物丙氨酸的生成。为防止丙酮酸被肌肉糜中的其它酶所氧化或还原在反应系统中加入了抑制剂溴乙酸。 二、实验操作 1.谷丙转氨酶提取液制备2g肝脏0.9NaCL 6mL海砂 200mg在低温下研磨成浆用稀薄的脱脂棉过滤得提取液滤液不清。 2.转氨作用 取试管2支按下表加入试剂加入试剂的单位为mL 试 剂 对照管 测试管 1谷氨酸 0.50 0.50 1丙酮酸钠 0.50 0.50
0.1KHCO3 0.50 0.50 0.025一溴乙酸可不加 0.25 0.25 煮沸
的酶液 0.50 — 酶液 — 0.50 加脱脂棉塞45℃水浴1.5h时时振荡内容物 2乙酸 6滴 6滴 沸水浴2min使蛋白质完全沉下过滤作层析 3.纸层析操作方法 取圆形层析滤纸1张在圆心处用圆规绘出直径为3cm的同心圆滤纸不可以折通过中心将滤纸绘成四等分扇形。用毛细管点样2-4次直径不超过2mm在滤纸的圆心上剪一小孔直径约1-2mm取一小滤纸条将下端剪成刷状在卷成灯芯插入圆形小孔不能使灯芯突出纸面将圆形滤纸平放在盛有层析液水饱和酚培养皿上使灯芯向下与溶剂接触用大小相同的培养皿盖在滤纸上溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层直到溶剂前沿移至距滤纸边缘约1cm处时停止展层时间为1h80-100℃烘箱干燥喷洒水合茚三酮的正丁醇溶液80-100℃显色。 三、实验结果 实验 血清谷丙转氨酶活力单位测定 一、实验原理 本实验用丙氨酸和α-酮戊二酸为底物经转氨作用生成谷氨酸和丙酮酸。丙酮酸与24-二硝基苯肼作用生成24-二硝基苯腙此物质碱性条件下呈棕红色其颜色的深浅与丙酮酸的含量成正比可用比色法进行定量测定。通过与标准溶液的比较即可计算出酶的活力单位。 二、实验试剂 11/15mol/L pH7.4的磷酸缓冲液取1/15 mol/L磷酸氢二钠称取Na2HPO4 9.47g或Na2HPO4·12H2O 23.87g溶于蒸馏水中定容至
1000mL825mL1/15 mol/L磷酸二氢钾称取KH2PO4 9.078g溶于蒸馏水中定容1000mL175mL混合。 2GPT基质液称α-酮
戊二酸29.2mg2μmol/L及α-DL-丙氨酸1.78g200μmol/L溶于50mLpH7.4的磷酸缓冲液中加0.1mol/L NaOH溶液0.5mL调pH为7.4然后加磷酸缓冲液定溶至100mL加少许氯仿防腐置冰箱中可保存一周。 31mmol/L 24-二硝基苯肼溶液称取24-二硝基苯肼20mg溶解于10mL浓盐酸中以蒸馏水定容至100mL。 42μmol/mL丙酮酸钠标准液精确称取丙酮酸钠22mg加磷酸缓冲液溶解后定容至100mL。临用前配制。 50.4mol/LNaOH溶液 三、实验操作 一标准曲线的绘制 试管 试剂 测定管 空白管 1 2 3 4 5 2μmol/mL丙酮酸钠标准液 mL — 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 GPT基质液mL 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 pH7.4磷酸缓冲液mL 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 充分摇匀后置于37℃水浴保温10min 24-二硝基苯肼溶液mL 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 充分摇匀后置于37℃水浴保温20min 0.4mol/LNaOHmL 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 充分摇匀后室温静置30min后520nm波长下比色 A520nm值 相当丙酮酸含量μmol — 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 相当GPT单位100mL — 100 200 300 400 500 以酶的活力单位数为横坐标以光吸收值为纵坐标绘制A520nm与对应的酶活力单位数的标准曲线。1丙酮酸钠标准液mL数×摩尔浓度2μmol/mL。2GPT活力单位为每mL血清在37℃与pH7.4的基质液作用60min生成1μmol丙酮酸为一个单位U。本实验临床检验取血清量为0.1mL报告数据以100mL血清计算因
此将实际测得结果×1000即可。 二酶活力的测定 试管 试剂 对照管 测定管 0 1 GPT基质液mL 0.50 0.50 37℃水浴预温10min 血清mL — 0.10 PH7.4磷酸缓冲液mL 0.10 0.00 充分摇匀后置于37℃水浴保温60min 24-二硝基苯肼mL 0.50 0.50 充分摇匀后置于37℃水浴保温20min 0.4mol/LNaOHmL 5.00 5.00 摇匀后静置30分钟520nm波长下比色。查标准曲线的对应值可得100mL血清中谷丙转氨酶的活力单位数 三实验结果 试 管 比色杯吸光值 吸光值 纯吸光值 对照管 测定管 查标准曲线得GTP单位 参考数值GTP单位 四注意事项
1. 所需试剂如基质液、丙酮酸标准液、24-二硝基苯肼等均需冷藏 2. 为防止溶血及其他因素对酶活性影响实验所用器皿应干净、干燥方可使用 3. 丙酮酸钠极易变质配试剂时应选择外观洁白干燥者否则应进行重结晶 4 .转氨酶只能用于α-L-Ala对D-Ala无催化作用。实验室多用α-L-Ala是因为便宜如果采用α-L-Aa则用量需减半 5. 如活性高于
500U/100mL应将血清稀释一定倍数重新测定结果应×稀释倍数 6.为保证操作结果可靠测定酶活性时应恒定pH、保温时间 7.选用固定分光光度计及比色杯减少误差。 实验
GPT/ALT在临床诊断意义及检测方法原理 一、GPT/ALT在临床诊断中的意义 转氨酶广泛存在于机体的各个组织中在肝组织中谷丙转氨酶活性较高在心脏中谷草转氨酶活性较高。在正常新陈代谢中血清内维持一定水平的转氨酶活性即
正常值。当组织发生病变时由于组织细胞肿胀、坏死或细胞膜破裂使细胞膜通透性增高而导致大量的酶释放至血液中从而引起血清中相应的谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性显著增高。因此测定其活性对肝、心脏的某些疾病的临床诊断具有重要的参考价值。 二、丙氨酸氨基转移酶试剂盒使用说明 1用途 本试剂用以测定人血清中丙氨酸氨基转移酶活力。 2基本原理 底物L-丙氨酸与α-酮戊二酸在ALT作用下生成丙酮酸生成的丙酮酸在乳酸脱氢酶作用下转化成L-乳酸同时伴随着NADH氧化引起在波长340nm处吸光度下降下降速率与血清ALT活力成正比。 L-丙氨酸 α-酮戊二酸→丙酮酸 L-谷氨酸 氨氨酸 NADH H→L-乳酸 NAD H2O 3.试剂盒组成 试 剂 成 分 含 量 溶液A Tris缓冲液pH8.5 0.1mol NADH 0.30mmol LDH ≥5.0KU/L 溶液B Tris缓冲液pH7.0 0.1mol L-丙氨酸 1020mmol α-酮戊二酸 36mmol 三、实验仪器 1.具有能在波长340nm处测定生化分析仪
2.30℃、37℃水浴箱 3.定时器 4.准确的加样器 四、操作方法 1.二步法 试 管 样本管 空白管 样 本 0.3mL — 蒸馏水 — 0.3mL 溶液A 2.0mL 2.0mL 混匀、放设定温度5min 溶液B 1.0mL 1.0mL 混匀准确记录时间放设定温度1min后在波长340nm处以蒸馏水校零连续监测1-2min计算
ΔA/min。 2.一步法 试 管 样本管 空白管 样 本 0.3mL — 蒸馏水 — 0.3mL 工作液 3.0mL 3.0mL 混匀准确记录时间
放设定温度1min后在波长340nm处以蒸馏水校零连续监测1-2min计算ΔA/min。 工作液制备溶液A与溶液B以2:1混合组成测定工作液。工作液在2-8℃避光保存可稳定3周。
五、实验结果 序号 1 2 3 4 吸光值 ΔA/min 计算公式 计算结果 参考数值 六、注意事项 1.本液体试剂按IFCC推荐法为基础设计采用二步法可防止胆红素的干扰 2.试剂与样本量可按生化分析仪要求衡比例改变 3.本试剂线性可达到600 U/L30℃或1000 U/L37℃当样本中ALT活力超过600
U/L30℃或1000 U/L37℃时可用生理盐水稀释即0.1mL血清加0.2mL生理盐水测定结果×3 4.如试剂变混或以蒸馏水为空白工作液在340nm处吸光度1.0请勿使用 5.贮存条件与有效期试剂在2-8℃避光保存有效期为1年如用一步法工作液在2-8℃避光保存可稳定3周。 实验 检测SGPT活性在科学研究中的应用 一、基本原理 测定SGPT活性可反映出肝细胞的坏死程度因此是检测肝功能损坏的灵敏指标之一。很多有毒物质易引起肝损伤造成肝实质细胞的变性及坏死例如四氯化碳CCl4等化学药物可以诱发动物发生急性中毒性肝炎和肝坏死。因此建立由CCl4诱发病变的动物模型然后检测SGPT活性常被用于滋肝补肾中草药物的筛选研究。 二、应用实例 红缘层孔菌多糖对CCl4中毒小鼠转氨酶SGPT活性的影响。 将体重20-22g小白鼠随机分为三组每组10只。第1组为正常对照第2组为四氯化碳中毒对照组第3组为给药
组。 给药组以150mg/kg体重的剂量给小鼠灌胃红缘层孔菌多糖液每日一次连续给药7天其余两组灌胃同体积生理盐水。于末次给药后24h给药组、四氯化碳中毒对照组均按10mL/kg体重剂量腹腔注射0.1CCl4豆油溶液正常对照组注射同体积豆油16h后对三组小白鼠摘眼球取血制血清按King氏法测定谷丙转氨酶活性100mL血清与与基质液在37℃条件下作用60min每生成1μmol丙酮酸为1个活性单位。结果见下表 红缘层孔多菌多糖对CCl4中毒小鼠SGPT活性的影响 组 别 SGPTuM±SD P值 正常对照组 205±17 P≥0.05 CCl4中毒组 336±34 给药组 217±13 由表中数据可见红缘层孔多菌多糖可抑制由四氯化碳损伤肝细胞引起的小鼠血清谷丙转氨酶活性的升高。