工业淀粉酶的纯化与分析
一．实验目的
1． 掌握盐析法纯化分离蛋白质的工作原理和方法
2． 掌握利用葡萄糖凝胶层析法进行蛋白质脱盐的技术
3． 掌握测定淀粉酶活力的基本原理和方法
4． 学习Folin-酚比色法测定蛋白质含量的原理和方法
二．实验原理
工业淀粉酶含有大量杂质将其溶解浸提后离心，利用高浓度的硫酸铵溶液将上清液的蛋白质沉降下来，所得沉淀溶解后即为盐析液。
利用葡糖糖凝胶G-25对大分子量蛋白质和小分子盐类的阻滞作用不同，从而经凝胶层析使盐析液中的蛋白质和盐类分离。
酶活力是以酶在最适条件下，催化一定化学反应的初速度来表示的。在本实验中，是以一定量的淀粉酶在37摄氏度，PH=6.8的条件下，每分钟水解淀粉酶生成1mg还原糖的量为一个酶活力单位，其中还原糖的量用DNS法测定。
蛋白质在Folin-酚试剂的作用下生成钨蓝和钼蓝，测定其在500nm波长下的吸光度 ，从而求得样品中蛋白质的含量。
三．实验材料及仪器设备
1． 材料：工业淀粉酶
2． 仪器：电子天平；离心机；UV9100型分光光度计
恒温水域；沸水浴
3． 器材：刻度试管：25ml*21；移液管：1ml*6、5ml*1；烧杯：250ml*2、50ml*1;
研钵：一套；移液枪：一套；离心管：100ml*1;1.5ml*4;7ml*1;注射器：1ml*1；
层析装置：1套；量筒：100ml*1；洗耳球：2个；胶头滴管：2个；移液管架；
玻璃棒
四．实验试剂
BaCl2溶液（1%） 考马斯亮蓝G-250
1%NaCl溶液 淀粉溶液（0.5%）
磷酸缓冲液（0.2molr/L,pH 6.8） NaOH溶液（2.5mol/L）
牛血清蛋白（BSA）标准液（250ug/ml）
Folin-酚试剂甲 Folin-酚试剂乙
葡萄糖标准液（1mg/ml） DNS试剂
五．实验步骤
1. 浸提
称取0.317g淀粉酶制剂，经浸提离心后转移上清液1.2ml于离心管中，标记为“粗酶液”备用。记录剩余体积为18.2ml并转移到50ml烧杯里，置于冰浴中。
2．盐析
按70%的饱和浓度称取6.976g(NH4)2SO4固体，研细后，缓缓加入离心后的酶液中。待(NH4)2SO4固体溶解后，冰浴静置20min后离心，将离心后固体溶解于4ml蒸馏水中，并分装于3支1.5ml离心管中，标记“盐析”备用。
3．脱盐
用洗脱液洗脱柱子，经检验没有残留的盐和蛋白质后,对蛋白质进行脱盐。用注射器注射0.5ml盐析液，上样完毕后，打开出水口，进行洗脱，并收集洗脱液，每管2ml。分别用BaCl2和考马斯亮蓝G-250试剂检验试管中洗脱液的成分。把含有蛋白质的收集液合并于离心管中，标记“脱盐”备用。
4．酶活力测定
粗酶液 0.05ml加蒸馏水稀释至25ml，摇匀待用
盐析液0.05ml加蒸馏水稀释至25ml，摇匀待用
脱盐液0.2ml加蒸馏水稀释至10ml，摇匀待用
5．蛋白质含量测定
粗酶液0.5ml加蒸馏水稀释到10ml，摇匀；
盐析液1.0ml加蒸馏水稀释到10ml，摇匀；
脱盐液直接取用；
样品处理：
取样2g豆芽研磨水100ml定容，摇匀 浸提10min过滤
取14支试管按下表操作并记录实验数据。
六、数据处理
1各样液浓度
①粗酶液浓度
②盐析液浓度
③脱盐液浓度
2各酶的活力计算
①粗酶液：
△A=A1-A0=0.337-0.177=0.160
代入y=0.5064x-0.0774中得△m粗=0.469mg
粗酶液样品量
粗酶液淀粉酶活力
样品总活力=15.129U/mg×310mg=4688.99U
②盐析液
△B=B1-B0=0.410-0.313=0.097
代入y=0.5064x-0.0774中得△m盐=0.344mg
盐析液样品量
盐析液淀粉酶活力
样品总活力=3.699U/mg×310mg=1146.69U
③脱盐液
△C=C1-C0=0.445-0.207=0.238
代入y=0.5064x-0.0774中得△m脱=0.623mg
脱盐液样品量
脱盐液淀粉酶活力
样品总活力=6.809U/mg×310mg=2110.79U
3纯化回收率
①盐析后回收率
②脱盐后回收率
4蛋白质的含量测定
①样品1
样品1的
=0.121
代入y = 0.0008x - 0.0011得
样=152.625ug=0.153mg
即得1ml样品1液的蛋白质含量=0.153mg
样品1的蛋白质总含量0.153mg蛋白/ml样液×100ml=15.3mg
豆芽中蛋白质含量
②粗酶液
粗酶液的
=0.187
代入y = 0.0008x - 0.0011得粗=235.125ug=0.235mg
1mg粗酶液中蛋白质的含量
称样总蛋白的含量=0.197mg蛋白/mg样品×310mg=61.07mg
③盐析液
盐析液的
=0.199
代入y = 0.0008x - 0.0011得盐=250.125ug=0.250mg
1mg盐析液中蛋白质的含量
称样总蛋白的含量=0.0403mg蛋白/mg样品×310mg=12.493mg
④脱盐液
脱盐液的
=0.162
代入y = 0.0008x - 0.0011得脱=203.875ug=0.204mg
1mg脱盐液中的蛋白质的含量
称样总蛋白的含量=0.0335mg蛋白/mg样品×310mg=10.385mg
5比活力计算
①粗酶液比活力
②盐析液比活力
③脱盐液比活力
6纯化倍数
①盐析液纯化倍数
②脱盐液纯化倍数
讨论
1、蛋白质的测定方法
①考马斯亮蓝法：考马斯亮蓝法对玻璃吸附较大，每次用完比色皿都需要酒精清洗，而且对于操作要求较高，每加一种试剂都要迅速摇匀，因为考马斯亮蓝试剂是用浓磷酸和乙醇配置的，如不摇匀，会导致蛋白质变性。适用于测定可溶性蛋白。
②紫外吸收法：此法简单易行，直接将蛋白质溶液置于280nm下进行吸收测定即可。要求使用石英比色皿，而且如用分光光度计测定，待测样品必须很纯，否则有杂质的话会造成影响。适用于可溶性蛋白。
③双缩脲法：双缩脲试剂即为碱性铜离子溶液，可与蛋白质生成紫色络合物，在500nm波长处测其吸光度即可。但其灵敏度比较低，且只适用于可溶性蛋白质的测定。
④凯氏定氮法：此法是将蛋白质当中的蛋白N全部转化为氨态N，再将其蒸发出，用硼酸吸收后再用盐酸滴定。通过滴定所用掉的盐酸的量计算出N的含量，对照经验系数，即可大致得出蛋白质的含量。适用于全部蛋白质。
⑤Folin-酚比色法：用于测定可溶性蛋白质，灵敏度高，测定范围为25-250ug，操作简便，是实验室最常用的方法之一。但要注意试剂甲中的OH—含量不能过高，否则Cu2+会沉淀。
2、酶活力也称为酶活性，用来衡量酶的多少，是指酶催化一定化学反应的能力。通常用最适条件下酶所催化的某一化学反应的速率来衡量没活力的大小。酶催化的反应速率越大，酶的活力越高，反之，酶活力越低。
酶活力表示方法：
国际单位（IU）：在25℃，其他条件均为酶的最适条件下，每min转换1umol底物需酶量为一个活度单位，IU。
（1）
终点法：测定完成一个反应所需要的时间
自定义单位
（2）动力学法：测定酶催化反应的初速度
3、比活力：国际酶学委员会规定酶的比活力为每毫克蛋白质所含有的酶活力单位数，以酶的活力单位/mg蛋白质表示。酶的比活力用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。
4、纯化回收率：用来衡量酶的纯化的好与差，纯化回收率值越高，则纯化方法越好。纯化回收率一定小于1，因为每纯化一步，都会有部分蛋白损失，回收率就下降点。
①盐析后回收率不是很高，推测原因可能是部分酶在实验过程中损失或者部分酶失活。
②脱盐后的回收率按理说应小于盐析后的回收率，而实验测得相反，可能是盐析后的淀粉酶液中存在(NH)2SO4，对淀粉酶的活性起了抑制作用。
5、纯化倍数：表示纯化效果，纯化倍数越高，纯化效果越好。
6、纯化回收率和纯化倍数是用来评价一个纯化方法好与差的指标。纯化回收率越高则纯化过程中酶的损失越少，体现了纯化方法的效果；纯化倍数反映的则是酶纯化效果的好于差，一般大于1，纯化后比活力提高越多，即纯化倍数越高，总活力损失越少，即回收率越高，纯化效果越好。
7、蛋白质的纯化方法
①等电点沉淀法
不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。
②盐析法
不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。
③有机溶剂沉淀法
中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。
⑵样品的进一步分离纯化
用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。
第二篇：工业试验报告
GJX4型光纤甲烷传感器工业性试验研究
总结报告
GJX4型光纤甲烷传感器（安标证号：MFB110276，防爆合格证号：1114383）是武汉理工大学和武汉理工光科股份有限公司研发生产的利用光谱吸收原理进行甲烷气体浓度实时监测的新型传感器。我矿先后在综采14214工作面、掘进14313皮顺和开拓28202高抽运输巷等地点安装GJX4型光纤甲烷传感器，与我矿现使用的催化燃烧式甲烷传感器进行对比试验。试验规模是井下安装9台GJX4型光纤甲烷传感器。通过9个月的运行，光纤甲烷传感器显示准确、运行稳定，与KJ90NB型监控系统兼容性好。
现将具体试验情况总结如下：
一、工业性试验研究过程
本项目于20##年1月开始实施，项目组首先到本项目试验基地——东曲矿实地考察，了解该矿使用的监控系统型号、配置和功能，与东曲矿通风科技术人员一起制定了“GJX4光纤甲烷传感器井下工业性试验研究实施方案”（详见附件1）。
依据实施方案，武汉理工大学于20##年2月26日把首批4台试验用GJX4甲烷传感器运送到东曲矿，在完成了该批传感器在井上的调试与观察运行之后，于28日安装到井下，分别在14214工作面T1、14313工作面皮顺T1和皮顺T2等地点在系统运行，另有一台在监控队调试室观察运行。东曲矿通风科技术人员，依据“GJX4光纤甲烷传感器井下工业性试验研究实施方案”的要求，记录试验数据，并与附近悬挂安装的热催化甲烷传感器的检测结果进行对比，而且在试验过程中，不再对GJX4光纤甲烷传感器做任何调校。
20##年8月武汉理工大学又发送4台GJX4甲烷传感器到东曲矿，分别安装在掘四18309皮顺T2、开二860东翼回风巷延伸T1、采掘准备队12410低抽巷T1、开一28202高抽运输巷T2等地点。
鉴于东曲矿新近购买了一批重庆煤科院生产的“矿用隔爆兼本安直流稳压电源KDW0.3/660（A）”，该电源箱输出直流电压为24V，采用两级过流和过压保护，允许外接的电容最大值为2.2uF，武汉理工大学第一和第二批发送给东曲矿的GJX4甲烷传感器因其输入电容稍大，不能直接跟该型号电源箱连接，为此，课题组采用在传感器的电源输入端串接入一个NTC功率电阻，抑制传感器启动瞬间的电流，从而能够保证GJX4甲烷传感器能够顺利接入KDW0.3/660（A）电源箱和KJ90-F16井下监控分站。20##年12月5日武汉理工大学寄发给东曲矿一台改进后的GJX4传感器，该传感器能够正常接入重庆煤科院KDW0.3/660（A）电源箱和KJ90-F16井下监控分站，兼容良好。
二、已完成的工业性试验内容
本项目严格按照合同要求实施各试验步骤，完成了全部的试验内容，达到了理想的试验效果，突出体现了GJX4光纤甲烷传感器的长期稳定性和对煤矿井下各类环境的较强适应性。
1、系统的安装与布设试验
完成了在综掘工作面、综采工作面、炮掘开拓面等地点安装布设GJX4光纤甲烷传感器的试验。
2、系统对矿井恶劣环境的适应性试验
把GJX4光纤甲烷传感器安装于井下综掘工作面、综采工作面、炮掘开拓面等不同地点，试验过程中不再对传感器进行任何形式的调校与维护，记录与对比传感器运行于各种不同的采煤工况下的监测数据，考察了传感器对高湿度、高粉尘、震动冲击等环境的适应性能。
3、系统与煤矿现有安全监测系统的兼容性试验
东曲煤矿使用的是煤科院重庆分院生产的井下监控系统，根据购置的批次不同，井下使用有多种电源箱和监控分站。通过与现用的多种电源箱和监控分站配接使用，考察了GJX4光纤瓦斯传感检测仪硬件的适应性和软件的匹配性。
4、长期稳定性试验
无维护连续在网运行，将其监测数据与人工现场检查、原有传感器监测数据进行偏差对照，对连续在网稳定运行时间等进行对比分析评价，确定了维护与调校周期大于6个月。
5、现场维护与保养方法试验
提出了现场维护与保养基本方法，完善了维护与保养基本程序。
6、对GJX4型甲烷传感器进行了如下改进：
1）对传感器的程序进行了修改，缩短了传感器的初始化时间。
2）根据该传感器接入重庆煤科院KDW0.3/660（A）电源箱和KJ90-F16分站时出现的电源过流保护问题，武汉理工大学对电路做了修改，在电源引入端串接入一个NTC功率电阻，解决了GJX4与该系统的兼容性问题。
3）修改了传感器标校程序，既方便了井下操作，也修正了瓦斯浓度小于0.10%时，直接显示为0.00%的情况。
三、试验总结
经过在井下各种环境和工况下近9个月的试验运行，已经完成和达到了项目预定的试验规模和试验环境，显示出GJX4光纤甲烷传感器能够适应煤矿井下的各类环境和工况，能够长期稳定、准确监测瓦斯浓度，能够跟现用的监控系统兼容，免维护运行周期在半年以上。
1、通过GJX4型甲烷传感器和催化燃烧式甲烷传感器的对比， GJX4型光纤甲烷传感器的精确性和稳定性较好。虽然两台传感器显示稍有差值，但是变化趋势相同，且其差值符合AQ1029—2007的规定。并入KJ90NB矿井综合监控系统运行稳定，兼容性好。跟系统配接能够达到AQ1029—2007所规定的性能指标。
2、通过悬挂安装在不同的环境，考核粉尘、潮湿水汽、振动、电磁干扰、高浓度瓦斯冲击以及CO、H2S、SO2等有害气体对传感器的影响。目前，已经确定CO、H2S、SO2等有害气体、潮湿水汽、振动、电磁干扰、高浓度瓦斯冲击对GJX4型甲烷传感器检测的准确性和稳定性没有影响。
3、使用中，GJX4传感器维护周期大于6个月。维护操作仅需要对防尘滤片进行清洁处理，无需更换传感探头、无需重新标校，简单方便。相比现用的催化燃烧式传感器需要每周调校，大幅度减小了维修人员的工作量。
4、能够与重庆煤科院生产的KJ90NB型监控系统及其多种型号的电源箱和井下监控分站良好兼容。
5、经试验测试，GJX4光纤甲烷传感器各项技术指标符合煤矿安全规范要求，与该产品使用说明书及其企业标准规定一致。
20##-12-19
附表1：GJX4光纤甲烷传感器工业性试验情况简表
