生物化学实验实验报告
实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳
分析小麦幼苗过氧化物酶同工酶
生物103班 1002040310 赵宁宁
搭档 1002040301 井 恬
一．研究背景及目的
电泳现象是自然界存在的一个非常普遍的现象。瑞典科学加Tisellius依据电泳现象发明了电泳技术，使得根据大分子的特性分离纯化大分子物质技术得到了相当大的进步，他也由此获得了1948年的诺贝尔化学奖。聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种比较普遍的电泳技术，采用聚丙烯酰胺作为电泳介质，主要分离纯化蛋白质等物质。同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。测定同工酶在理论上和实践上都有重要的意义。过氧化物酶是植物体内普遍存在的活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用以及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。本是按采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶的同工酶，根据没的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本次实验我们将学习并掌握聚丙烯酰胺垂直板电泳技术，熟悉相关操作流程，并且通过分离检测研究过氧化物酶同工酶熟悉过氧化物酶同工酶的作用机理。
二．原理
1.过氧化物酶同工酶
同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。他们是DNA编码的遗传信息表达的结果。最近的研究表明，同工酶与生物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一定的关系。因此，测定同工酶子啊理论上和实践上都有重要意义。用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便，灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察，记录和保存。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用以及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中他的活性不断发生变化。因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳技术
带点粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。由于带电胶粒或分子中的各种成分，所具有的电荷和分子量不同，在电场中将以不同的速度移动，因而在电泳进行过程中，不同的成分将按照各自的迁移速度得到有效的分离。
电泳可分成三大类：显微电泳、自由界面电泳和区带电泳。区带电泳是应用面最广，最重要的电泳实用技术。区带电泳是指胶体在各种不同的惰性支持物中进行电泳，不同组分形成带状区间。正因为支持介质的存在，减少了界面异常现象干扰和样品的扩散程度，所以适于分离鉴定氨基酸、核苷酸等小分子，以及蛋白质、核酸等大分子物质。区带电泳一起简单，操作方便，分辨力高，目前根据常用的支持物介质的不同物理性质，答题可以分为四类：滤纸及其它纤维薄膜电泳、凝胶电泳、分膜电泳和线丝电泳。
本次试验采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，属于凝胶电泳的一种。聚丙烯酰胺凝胶电泳实用性最强，凝胶机械性能好、有弹性、透明、化学上稳定、对pH和温度变化不敏感、为非离子型、没有吸附和电渗作用等，尤为突出的是实验中所需样品量小（1-100μg），而分辨率又高。还可以通过改变浓度和交联度来控制不同大小的凝胶孔径，取得更好的分辨效果。聚丙烯酰胺凝胶电泳已被广泛应用与许多学科中，在日常样品分析、分离、纯度鉴定、分子量测定中，是一个很有价值、有时甚至是不可缺少的技术。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体（Acrylamide，Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（N,N’-MethylenaBisacrylamide，Bis），在催化下聚合而成的。Acr和Bis在他们单独存在以及混合时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤，但在具有自由基团体系时，他们就聚合，引发产生自由集团的方法有两种，即化学法和光化学法。光聚合法形成的凝胶孔径较大，而且随着时间的延长而逐渐变小，不太稳定个，所以用它制备大孔径的浓缩胶较为合适，采用化学聚合形成的凝胶孔径较小，而且重复性好，常用来制备分离胶。聚丙烯酰胺的基本结构，为丙烯酰胺单位构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联接起来。链的纵横交错，形成三维网状结构，使凝胶具有良好的抗对流作用。此外，长链上富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶。该结构中不带电荷，在电场中电渗现象几位微笑。以上特点是聚丙烯酰胺特别适于作区带电泳的支持介质。聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。没100ml凝胶溶液中含有的单体和交联剂的总克数成为凝胶浓度，用T%表示。凝胶溶液中，交联剂占单体和交联剂总量的百分数成为交联度，用C%表示，改变凝胶浓度和交联度，可获得不同密度、粘度、弹性、机械强度和孔径大小的凝胶，以便适应各种样品的分离。一般常用7.5%浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，根据蛋白质与核酸分子量不同，适用的浓度也不同。
电泳仪由两部分组成，即稳压（稳流）直流电源盒缓冲液贮存系统（电泳槽）。该系统由两个缓冲液贮液槽组成，两槽缓冲液由支持介质联通，每个贮液槽均装有铂电极，点击通过导线与直流电源相接，形成回路。电泳槽的种类很多，主要有以下几种：吹直管型盘状电泳、垂直板型电泳、垂直柱形盘状电泳、水平板型电泳。本实验采取的是垂直言行电泳槽。本实验采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶系统，分离小麦过氧化物酶同工酶，系统的不连续性表现在以下几个方面：凝胶浓度和交联度的不同（上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶），缓冲液例子组成及各层凝胶的pH不同（本实验采用碱性系统，电极缓冲液为pH 8.3的Tris-Gly缓冲液，浓缩胶为pH 6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH 8.9的Tris-HCl缓冲液），电位梯度不连续（因pH不连续）。
由于电泳系统的不连续，所以存在着三种物理效应：点和效应、分子筛效应和浓缩效应。在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。
3.样品的检出及分析鉴定
电泳结束后，撤出凝胶板，利用被分析物质如蛋白质、核酸等的一些特意颜色反应，荧光反应及同位素示踪技术确定条带位置，进行定性定量鉴定，目前有进一步发展了诸如光密度扫描仪等先进手段，为电泳的定量分析开创了新天地。凝胶的保存有两种方法，一是制成干胶，而是浸泡在适当的液体保护液里，一般均可以长期保存，已被日后所需。
过氧化物酶在分解过氧化氢的过程中产生自由氧基，能使联大茴香发生颜色反应，产生褐色的化合物，所以用联大茴香胺染色液浸泡过的凝胶板上，有过氧化物酶同工酶蛋白质带的部位可以看到褐色的谱带。联邻茴香胺在酸性,低温条件下与亚硝酸作用生成四氮盐.四氮盐有两个重氮盐,其中一个重氮基在碱性条件下与所要显示的组氨酸,色氨酸及酪氨酸的苯环结合产生偶联反应,另一个重氮基与酚类或奈类发生偶联反应以增色。因此,可以用生成的偶氮染料来代表组织细胞的蛋白质含量。
三．仪器与试剂
1.实验材料
小麦幼苗。
2.实验仪器及试剂
仪器：电泳仪一套（稳压电源及垂直板电泳槽）
器具：烧杯50ml×4、100μl微量进样器、大培养皿一套；
试剂：见下表。
四．实验方法/操作步骤
1.操作步骤
（1）贮液配制（教师完成）
按上表配制贮液，但应注意
1.配好的丙胶贮液用棕色瓶盛装置冰箱内保存，可放1~2个月；
2.过硫酸铵应当天配制；
3.如有不溶物应过滤；
4.染色液应当天配制；
5.电极缓冲液用时稀释10倍。
（2）凝胶的制备
1.将贮液由冰箱取出，待与室温平衡后再配制工作液；
2.安装电泳槽。安装时，注意旋紧螺丝时，需均衡用力，以免夹碎玻璃片；
3.用2%的琼脂糖封底，以防漏胶；
4.按下表所示配制分离胶
在小烧杯中混匀后，立即灌胶，灌胶时，将电泳槽略微倾斜，用手扶稳，将小烧杯尖端 抵在长玻璃片顶端中央某点，小心倒入两玻璃片之间，灌至距短玻璃片顶端2cm左右即可，放平电泳槽，立即用滴管在胶的上层小心轻缓地覆盖约2~3mm厚的水层；灌注水层时要均匀轻缓，以防在胶顶部产生漏洞，影响结果，刚加水时，可看出界面，后逐渐消失，等到再出现界面时，表明分离胶已聚合，再静置一会儿（此过程大约10min），便可将水倒出，可用滤纸条从一侧略微吸浸，注意不要碰毁胶面，然后准备灌注浓缩胶。
5.按下表所示配制浓缩胶
配制均匀后，立即灌胶，操作同分离胶的灌注，当胶面达到距短玻璃片0.5cm左右即可，然后立即插入样品槽模板（梳子）。聚合完成后，在电泳槽内倒入电极缓冲液，然后小心拨出梳子，准备点样。
（3）样品的制备
称取小麦幼苗叶片1g，放入研钵内，加pH 8.0的样品提取液2ml，于冰浴中研成匀浆，然后以4ml提取液分几次洗入离心管，在告诉离心机上以8000转/分离心10分钟，倒出上清液，以等量40%蔗糖混合，即为样品液。
同上操作，再备一份其根部的样品液。
（4）点样
样品液中加入1-2滴溴酚蓝→ 微量进样器点样（梯度上样，每种5μl、15μl、30μl、50μl）
（5）电泳
接好电源线（上槽接负极，下槽接正极）→ 控制电流（浓缩时15mA，分离时25mA）→ 指示剂到末端0.5~1cm处停止。
（6）剥胶、染色及记录结果
将凝胶置于大培养皿中，进行染色反应（浓缩胶可以去掉）。
染色过程如下：
1.向大培养皿中倒入约50ml pH4.7乙酸缓冲液，将胶板淹没，室温浸泡10min。
2.倒掉乙酸缓冲液，加入联大茴香胺染色液，将胶板淹没，室温下浸泡20min，在此期间会出现过氧化物酶同工酶的谱带，待染色条带充分显色后观察记录酶谱并分析结果。
2.结果记录
最终得到的电泳图谱如下（左侧四个条带为根，右侧为叶）：
五．结果分析与讨论
1.结果分析
如图中所示，左侧为根，右侧为叶，浓度梯度不同。电泳后不同的蛋白质在电泳中分成不同的条带，根据其颜色和位置可以判断过氧化物酶同工酶的浓度和种类。从图中可以看到，同一高度（相同分子量）在叶和根的图谱上都有条带,但是颜色深浅不同（如位置1），说明这种酶在根和叶中均有分布，但是在根和叶中的量是不同的。还有如位置2，只在叶的图谱上有条带，这说明这种酶只在叶中有，根中是没有的。如位置3，与位置2恰好相反，说明这种酶只存在于根中，叶中没有这种酶。整体来看，过氧化物酶的同工酶的种类多，分布不均。但是要求证其具体种类就需要依据其他的手段来确定了。
2.思考讨论
本次实验结果合理，符合预期，整体上比较成功。本次实验的主要目的是学会垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳。主要实验装置是电泳仪。电泳槽是一个很复杂的实验装置，很多操作步骤必须十分小心，才能保证减小因人为操作而引起的实验误差。需要注意以下几点：
1.倒胶。凝胶是被两片薄薄的玻璃板成型固定的，其厚度也非常小。玻璃板的安装要十分小心，一定是要先装好一个角，然后顺着边缘将整个玻璃板固定到橡胶槽中。其后用琼脂糖封胶很重要，避免虹吸现象的发生，造成对最终凝胶的影响。凝胶分为分离胶和浓缩胶两部分。先倒好的是下面的分离胶部分。在这一步要注意的是胶的高度要掌握好（将“梳子”插在两玻璃板中间，其下方一厘米左右），这样能保证浓缩胶与分离胶的高度比例，保证电泳条带的正常良好的分离显现。我们小组在实验中就是分离胶的高度倒得太低了，不得不在第一次倒得浓缩胶凝固之后又补了一层浓缩胶至合适高度，导致我们最终的浓缩胶层中有一个断层，可能会对实验造成一定的影响。但是从实验结果来看，这步失误对实验结果造成的影响不大，得到的电泳图谱还是很连续的。另外，在配制浓缩胶与分离胶的时候，要注意各试剂的加入顺序。而且，在加入过硫酸铵后要马上倒胶，操作过慢的话可能造成中途凝胶便凝固了。
2.凝胶倒完以后残余的胶液一定要等待其凝固了，才能挑出来丢弃，因为凝胶充分的交联以后才没有毒性了，这样就避免了对环境造成污染。
3.在插入样品槽模板，倒入的浓缩胶凝固以后，取出样品槽模板动作要轻，因为浓缩胶凝固以后也是很软的，固定出来的上样孔容易变形。如变形了，就用上样器的针头对其进行休整，尽量使其规整，这样才能保证上样后电泳条带的位置尽量的规则。
4.在电泳开始的前一段时间，前沿指示剂——溴酚蓝的行为特别有趣，以至于我们都以为蛋白质样品都扩散聚集混在一起了。但是事实不是这样的，这只是溴酚蓝特有的性质。
5.整个电泳系统是一个完整的回路。电流经正极流出，经过电极缓冲液，从封口的琼脂糖凝胶穿过，流入凝胶体系，然后向上流出凝胶，最终再次通过电极缓冲液流入负极。
6.蛋白质电泳时电极缓冲液是不能淹没凝胶的，这也大概是蛋白质电泳大部分使用垂直板的原因吧。如果电极缓冲液没过了凝胶板，则电流就会从电极缓冲液中溜走，导致真正加在凝胶两端的电场强度不大，使得电泳跑的很慢。使用垂直板可以避免这个问题，而且垂直板电泳的时候电极缓冲液是在两侧包着凝胶体系的，可以起到对凝胶降温的作用。
7.在剥胶的时候一定要轻，因为凝胶本来就很脆弱，稍不小心就会把凝胶弄断。而且在剥胶的时候要注意标记，记清楚那边的叶的电泳图谱，那边是根的电泳图谱。
七.结论与展望
本次实验数据结果符合预期，比较成功。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳的学习使用让我们更加深刻的了解到了这一在蛋白质研究领域至关重要的技术。纵观整个实验，虽然原理不难理解，但是真正的操作确实需要十分用心的。在实验中，我们也大致了解到了蛋白质电泳与核酸电泳的不同之处，我们也对其不同点做出了稍稍的探究。希望我们能够在以后的学习研究中掌握更多的蛋白质电泳技术，对我们以后的研究工作打下坚实的实践基础。
八. 思考题及质疑
1.电泳凝胶缓冲系统（电极缓冲液、浓缩胶缓冲液、分离胶缓冲液）在电泳技术中的作用？
答：电极缓冲液的作用是在浓缩胶中形成不连续的高电位梯度，而在分离胶中形成均一的电位梯度。在电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。大大提高了电泳的灵敏度。
总体来说,缓冲系统给整个系统维持了各自所需的pH梯度且不发生大的变化,保证电泳能够按照预期进行.
2.样品中加入40%蔗糖溶液的作用是什么？
答：加入蔗糖是为了增加样品的比重，让样品顺利的沉入上样孔中，不使样品从上样孔中飘出来。
3.两个电泳槽中的电极缓冲液用过一次后，是否可以混合后再用？为什么？
答：不能。因为电极缓冲溶液的缓冲能力与组成缓冲溶液的组分浓度和pH值有关，在电泳过程中水会被电离生成氢气和氧气，两个电泳槽的电极缓冲液用过一次后，缓冲液里离子的浓度会增大，造成缓冲液的缓冲能力发生变化，离子强度过大，会影响到蛋白质的活性，使电泳速度减慢，条带不清晰。所以不能混合后再使用。
4.利用电泳技术获得漂亮实验结果的关键因素主要是那些？为什么？
答：主要由以下两个方面：
凝胶的制备。两种胶制备完成后需立即灌胶，因为加入TEMED和过硫酸铵后，胶即刻反应，若不及时灌胶则会导致凝胶凝固不均匀，形成条带形状不规则。覆盖水层时要轻缓，若过猛则会冲撞胶面导致分离起点不一致影响实验结果。灌胶完毕后要立即插入梳子，否则凝胶凝固再插梳子则会毁胶。拔梳子时应垂直向上，均匀用力，缓慢拔出，否则会导致样品槽损毁。总之，若凝胶制备出现问题则直接导致电泳条带不清晰、变形、拖尾等，直接影响实验结果。其余操作细节在实验讨论部分由详细的阐述。
电泳。电流的调控，接触不良、缓冲液液位太低或者缓冲液离子强度太小导致电阻太大,电流变小。这时如果通过调高电压来使电流增大还可能会烧胶。电流过大、过热也会导致凝胶变性从而达不到分离样品的目的。
5.应用或研究的需要和理论上的可行性以及时间中的可操作性是一项技术得以发明的三大前提条件,而完成后的应用实效反过来又会对前期的设计予以进一步修正和指导甚至提出新的问题,比较电泳技术与层析技术的异同点,说明为何基于进一步提高生物大分子纯化水平而被发明的电泳技术,最终却是更为广泛的应用于样品的分析鉴定而并非最初定位的分离纯化?这种转化给我们说明启示?
答:开始设计发明电泳技术的定位是利用物质的电性来分离纯化。但是电泳技术在真正实践的时候暴露出的不足之处却是无法避免的。在电泳时，上样量太小。上样量在电泳中是无法像层析技术那样，只要需要分离的样品多就可以无限大按比例增加分离体系的量从而达到大量物质的分离。在电泳中，如果一次上样量太多，样品内部的部分受到的电极给的力就会减小，从而导致电泳过程中发生偏差。而层析技术却不受此限制，上样量可以无限的放大。但是小量上样的时候电泳技术的精确度较高，适于进行物质的鉴定。还有，如果使用电泳技术来分离大量物质的话，凝胶介质的厚度就要求很厚。这样的话，由于凝胶很厚而导致的因电流流通产生的焦耳热不能很好地散发掉造成体系过热，从而对样品造成一定的影响，比如使蛋白质变性。所以，电泳技术便成为了分析鉴定的普遍技术，而层析技术却是分离纯化任何量的物质的良好的实验手段。这种转化给我们的启示是，根据某个原理发明出来的实验技术在经过实践的检验后可能在原来的方向上被pass掉，但是技术的核心是新兴的，科学的理论的话，总会有另一扇大门打开，该技术也最终会被在新的更加适合的领域广泛应用。
十.参考文献
[1]生物化学实验指导.中国农业大学自编教材.